Práctica 13: Deteccion de maíaz transgénico por PCR

OBJETIVO

El objetivo de este experimento es introducir a los estudiantes en los principios y práctica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) como herramienta para la detección de organismos modificados genéticamente.

EXPOSICIÓN DE LOS HECHOS

Vamos a ir al mercado a comprar diferentes productos alimentarios que contiene maíz para ver si pertenece a una variedad normal o transgénica.

Para ello lo primero que haremos será la extracción del ADN de los diferentes alimentos seleccionados:

1. Harina de maíz marca A.
2. Harina de maíz marca B.
3. Harina de Maíz BIO.
4. Sémola de maíz.
También pueden utilizarse otros productos con maíz que se decidan (es importante trabajar con muestras pulverizadas, por ejemplo, utilizando un molinillo).
Seguidamente, utilizaremos la MIX de PCR para la detección de maíz transgénico Bt.
COMPONENTES

 Tampón de electroforesis concentrado 10x                               100 ml

  Agarosa                                                                                           6.0 gr

Muestras maíz para extracción                                                 4 muestras

Kit extracción ADN alimentos                                                   para 25 muestras

MIX PCR Detección maíz transgénico                                           2 x 350 µl

         Control positivo ADN normal                                                     10 µl

      Control positivo ADN transgénico                                                10 µl

               GELSAFE tinción ADN                                                           25 µl

Tampón de electroforesis 10 X para preparar Tampón de electroforesis 1 X que es el Tampón de trabajo para hacer los geles y el de la cubeta.

PROTOCOLO

A) EXTRACCIÓN DEL ADN DE ALIMENTOS QUE CONTIENEN MAÍZ

Se realizarán 4 grupos de trabajo.

Se suministran 4 muestras de alimentos que contiene maíz y se ha de detectar la presencia de ADN de maíz normal o transgénico: 1.Harina de maíz marca A; 2.Harina de maíz marca B; 3.Harina de Maíz BIO; 4.Sémola de maíz. También pueden utilizarse otros productos con maíz que se decidan (es importante trabajar con muestras pulverizadas, por ejemplo, utilizando un molinillo).

Para la extracción de las muestras suministradas utilizar 100 mg y para las muestras que se quieran evaluar empezar por 200 mg.

B) REACCIÓN DE LA PCR

NOTA: Utilizar siempre puntas con filtro y cambiar de punta cada vez que se realiza una acción para evitar contaminaciones que puede dar lugar a falsos resultados.

1. Utilizar 2,5 l (100-250 ng) del ADN de cada extracción de ADN.

IMPORTANTE:

a) Preparar un control negativo de amplificación, para ello colocar 2,5 l de agua libre de nucleasas en lugar del ADN, esto sirve para saber si los reactivos o micropipetas y puntas pueden estar contaminados con ADN, no se ha de amplificar nada.

b) Preparar un control positivo de amplificación, para ello colocar 2,5 l del control positivo ADN normal y ADN transgénico.

2. Las concentraciones típicas de los primers y parámetros utilizados dependerá de cada sistema utilizado. Una concentración final típica de primers es 0,5 µM.

     REACTIVOS                           VOLUMEN

       MIX PCR                                22,50 µl

ADN (100-250 ng)                         2,5 µl

   Volumen Total                            25 µl

 3. Mezclar bien, el colorante rojo está incluido en la polimerasa facilita el proceso.

4. Realizar el proceso de amplificación.

IMPORTANTE: Para la activación de la Polimerasa “HOT STAR” es necesario programar un paso de desnaturalización inicial de 10 minutos a 95ºC, después programar los 30 o 40 ciclos específicos de cada producto a amplificar.

                                                             PROGRAMA PCR TRANSGENICOS 

                 PASO                                      TEMPERATURA             TIEMPO

Desnaturalización HOT STAR                     95ºC                      10 minutos                                           Ciclos PCR Realizar 35 ciclos                                  95ºC                      30 segundos

                                                                         66ºC                      30 segundos 

                                                                       72ºC                      45 segundos

          Extensión final                                    72ºC                     10 minutos

                  Final                                             4ºC

5. El producto de la PCR puede ser sembrado directamente en un gel de agarosa 3.0% después de la PCR, ya que el colorante rojo actúa como tampón de carga.
6. Utilizar el método de detección o tinción del ADN que se use en el laboratorio. Le recomendamos el uso del GELSAFE suministrado con el kit.

RESULTADOS

1: Marcador de peso molecular.
2: Control positivo ADN normal.
3: Control positivo ADN normal.
4: Control positivo ADN transgénico.
5: Control positivo ADN transgénico.
Se presenta un ejemplo de resultado de la amplificación de los controles positivo ADN normal y ADN transgénico que se suministran en el kit. Podemos observar en el caso de maíz normal la única banda de 226 pb y en el caso de maíz transgénico la presencia de las 2 bandas.
Se observa también un fragmento de mayor tamaño que se trata de una amplificación inespecífica pero que no afecta al resultado, y la formación de dímeros de primers, cosa muy habitual y que es la unión de los primers formando fragmentos mayores.

PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE 100-200 mg DE ALIMENTOS QUE CONTIENEN MAÍZ

Dada la gran variedad de muestras que abarcan los alimentos que contienen maíz se hace difícil presentar un protocolo universal para todas las muestras.
El principal y más importante paso para obtener buenos rendimientos es una buena rotura y homogenización de la muestra que será específica para cada tipo de muestra. En todos los casos y para una mayor efectividad se debería utilizar nitrógeno líquido para pulverizar la muestra.
En muestras sólidas en polvo (harinas, etc.) homogenizar con un homogenizador eléctrico de mano; En muestras sólidas de gran tamaño (copos de maíz, chocolate, galletas, etc) utilizar un molinillo de café para pulverizar una muestra grande y luego pesar la cantidad requerida de polvo.

1.       Pesar 100-200 mg de la muestra en un microtubo de 2.0 ml y añadir 1.2 ml de Tampón CTAB-1. Vortex vigorosamente. Incubar a 70ºC durante 30 minutos. Repetir el vortex varias veces durante la incubación. En las muestras suministradas en el kit pesar sólo 100 mg.
2.       Centrifugar a 14.000 rpm durante 10 minutos. Aparecerá un pellet y en la superficie una capa de grasa, introducir la punta de pipeta atravesando esta capa superficial, intentando recoger sólo 600 µl de sobrenadante que es el líquido transparente con color (evitar coger pellet y capa superficial) y colocar en un microtubo de 1.5 ml.
3.       Añadir 300 µl del Tampón de Lisis/ Unión + 25 µl Proteinasa K a los 600 µl de sobrenadante. Mezclar bien. Incubar a 70ºC durante 10 minutos.
4.       Añadir 225 µl de Isopropanol. Mezclar bien.
5.       Añadir la mitad del líquido en el reservorio de la Spin microcolumna con su tubo de recogida. Centrifugar a 10.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el tubo de recogida.
6.        Repetir el punto N.5 con el líquido restante.
7.       Colocar la MicroSpin columna en un nuevo tubo de recogida y añadir al reservorio 500 µ de Tampón de Desinhibición. Centrifugar a 12.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
8.       Añadir 500 µl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 12.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
9.       2º Lavado. Añadir 500 µl de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin microcolumna. Centrifugar a 14.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.
10.   Centrifugar a máxima velocidad durante 3 minutos para eliminar el etanol residual.
11.   Eliminar el tubo de recogida e insertar la spin microcolumna en un microtubo de 1.5 ml. Añadir 150 µl de Tampón de elución (precalentado a 70ºC) en el centro de la membrana blanca. Incubar 2 minutos.
12.   Centrifugar a máxima velocidad durante 60 segundos. El microtubo contiene ahora el ADN.